1.DNA/RNA提取:从样本(如咽拭子、血液等)中提取病毒或目标生物的核酸(DNA或RNA),这是后续扩增和检测的基础。
2.逆转录(针对RNA模板):若检测对象为RNA病毒(如新冠病毒),需先通过逆转录酶将RNA转化为互补DNA(cDNA),以便进行PCR扩增。
3.PCR扩增
-变性:加热使DNA双链解离为单链(通常94℃左右)。
-退火:降温使特异性引物与单链DNA结合(温度根据引物设计而定)。
-延伸:在DNA聚合酶作用下,以引物为起点合成新DNA链(通常72℃左右)。
-通过多次循环(通常25-40次),目标序列呈指数级扩增,微量核酸被放大至可检测水平。
4.荧光信号检测:试剂盒中预加入荧光标记的探针,该探针与扩增产物特异性结合后释放荧光信号。实时荧光定量PCR仪通过监测荧光强度,绘制扩增曲线。若样本含目标核酸,荧光信号随扩增循环数增加而增强;若无则无信号。
核酸检测PCR试剂盒的优点:
1.高灵敏度:可检测极低浓度的核酸(如早期感染或无症状携带者),降低漏检率。
2.高特异性:引物和探针的设计基于目标基因的特殊序列,仅识别特定病原体,减少交叉反应风险。
3.快速高效:相比传统病毒培养方法,PCR试剂盒能够更快地得出检测结果,大大缩短了诊断时间。
4.安全性高:试剂盒中的化学成分相对稳定且易于保存和运输,降低了操作过程中的安全风险。同时,PCR反应在封闭管内进行,避免了污染和扩散的可能性。
5.重复性好:由于PCR技术的高保真性和试剂盒的稳定性,使得不同批次或同一批次内的实验结果具有很好的一致性。
6.稳定性强:试剂盒组分经过优化配方和严格质控,确保在不同环境条件下均能稳定发挥作用,保证检测结果的准确性。