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抗卵巢抗体透明带(Zona pellucida,ZP) 抗体检测
更新时间:2011-03-10   点击次数:2063次

抗卵巢抗体透明带(Zona pellucida,ZP) 抗体检测


       透明带(Zona pellucida,ZP)是围绕在卵细胞周围的一圈嗜酸性、明胶样结构。ZP有很强的免疫原性,能诱发机体产生全身与局部的细胞与体液免疫,产生抗透明带抗体(anti-zonapellucidaantibody,AZP)。AZP与女性不孕症有关。检测AZP的方法有免疫沉淀反应,间接免疫荧光法,间接血凝,胶乳凝集试验,RIA及ELISA法等。无论何种检测方法,均需透明带抗原。由于猪和人卵透明带有共同抗原,故可用猪卵透明带抗原作试验。以下介绍间接ELISA法检测AZP。

     1.试剂  ZP精制抗原:用注射器从新鲜猪卵巢中吸取卵泡液,在解剖镜下从卵泡液中收集卵子,用PBS洗数次,放在含0.1%枸橼酸钠的0.05mol/LPBS(pH7.0)中,强力振荡lmin,然后用PBS洗几次。再将卵子加热溶解后可获得热溶解抗原,即猪ZP的粗制抗原。经SephadexG-100凝胶过滤组分后便可获精制抗原。可选用高70cra,直径1.2cra的层析柱。凝胶柱用0.01mol/L,pH7.4PBS流洗平衡后,加样,再用PBS洗脱,分管收集。将*蛋白峰用30%聚乙二醇或变色硅胶浓缩,经PBS透析24h后即为ZP精制抗原。

   2.操作步骤  每孔用0.1mLZP精制抗原(浓度用方阵法滴定)包被,置4~C过夜,用洗涤液洗3次,每次3min:每孔加含10%小牛血清的PBS 0.1mL,37~C封闭30rain,用洗涤液洗3次。加待测血清0.1mL,37℃!h后洗3次。加zui适浓度HRP-羊抗人IgC 0.1mL,37~C反应1h,洗涤。加新鲜配制的底物溶液,每孔0.1mL,室温作用20min后,各孔加2mol/LH2S040.1mL终止反应。

     3.注意事项  如果用猪ZP做为抗原检测人血清AZP,待测血清须用猪红细胞吸收。如用人卵ZP作为抗原,待测血清须用AB型人红细胞吸收。

    4.结果判定与临床意义  与阳性、阴性对照血清参比,目测显黄棕色者为AZP阳性, 无色或极淡黄色为阴性。也可测492nm的吸光度(A)值。若待测标本A值大于或等于阴性对照血清A值的X+2.5S为阳性。

 

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